Ni Tanrose 6FF（NTA）親和介質是將金屬離子Ni2+螯合在以氨三乙酸（NTA）為配基的瓊脂糖凝膠上形成的親和層析介質，較 IDA 結合Ni2+牢固一些。具有吸附量大、選擇好、易于再生、成本低等特點，廣泛用于生物制藥和生物工程下游蛋白質和多肽的分離純化，尤其是組氨酸標簽蛋白質的高效純化。

Ni Tanrose 6FF（IDA）親和介質是將金屬離子Ni2+螯合在以亞氨基二乙酸（IDA）為配基的瓊脂糖凝膠上形成的親和層析介質，是一種非常悠久的Ni2+親和填料，由于Ni2+與配基鰲合鍵較少，容易受到小分子的攻擊而使Ni2+容易脫落，但其載量也相對較高。

以下是使用NTA/IDA填料可能會出現的問題及解決方法：

01 通過His標簽純化的蛋白，雜質比較多應當怎么做？

①可能原因：蛋白酶會降解部分目的蛋白。

解決方法：加入多種蛋白酶抑制劑改進。

②可能原因：雜質蛋白與鎳柱親和力強。

解決方法：可提高雜質蛋白與鎳柱結合起始咪唑濃度。

③可能原因：雜蛋白和目的蛋白結合。

解決方法：可通過超聲前加入去垢劑或者還原劑消除（1%-2% Triton X-100）。

④可能原因：洗滌不充分。

解決方法：增加洗滌的次數，充分洗滌。

02 標簽蛋白不與金屬螯合親和層析柱結合應當怎么做？

①可能原因：超聲的功率不對（功率太大會導致蛋白炭化，功率太小會導致蛋白沒有釋放）。

解決方法：改變超聲功率或超聲前嘗試添加溶菌酶增加細胞破碎率。

②可能原因：組氨酸標簽暴露不完Q。

解決方法：在變性條件下（4-8M脲或4-6M鹽酸胍）進行純化，此時Ni-6FF（IDA）中鎳離子容易脫落，可選擇耐受變性劑的螯合填料，如月旭科技的親和填料Ni Tanrose 6FF（NTA）。

③可能原因：His標簽丟失。

解決方法：WB檢查His-tag是否表達，上游構建，改變His-tag的位置（C-端或N-端），必要時增加標簽個數；孵育的時間不夠，降低流速和增加孵育的時間。

03 用幾次后鎳柱載量下降、掛柱效率低，應該怎么做？

可能原因：

逐漸積累沉淀，變性或非特異結合的蛋白占據了有效的結合位點，并且通過洗脫液無法*清洗所致。

解決方法：

較溫和的清洗方式：用2倍柱體積的6M鹽酸胍或8M尿素洗滌，然后用5倍體積的緩沖液洗滌，以去除沉淀或變性物質，接著用2倍柱體積的1% Triton X-100洗滌，然后用5倍柱體積的緩沖液洗滌，以去除疏水結合的物質。若改變不明顯，可選擇強烈清洗方式。

強烈清洗方式：首先用5-10倍柱體積的脫鎳緩沖液（20 mM 磷酸鈉，0.5 M NaCl,，50 mM EDTA，pH 7.4）洗滌，進行脫鎳操作，然后用5-10倍柱體積的平衡緩沖液沖洗，最后用5-10倍柱體積的雙蒸水沖洗；隨后進行清洗操作，去除離子型雜蛋白，可以用5倍柱體積的1.5M NaCl溶液，然后10倍柱體積的雙蒸水沖洗；去除沉淀或變性蛋白，可以用1M*溶液，結合1-2小時，然后用10倍柱體積的平衡緩沖液和10倍柱體積的雙蒸水迚行沖洗；去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用5-10倍柱體積的30%異丙醇溶液清洗，然后10倍柱體積的雙蒸水洗滌；最后進行生鎳操作，用0.1M硫酸鎳上柱，隨后5倍柱體積的雙蒸水和平衡緩沖液迚行洗滌。如需保存，保存在20%乙醇溶液。

04 簽蛋白結合在填料上洗脫不下來，應該怎么做？

①可能原因：洗脫條件太溫和（標簽蛋白仍然結合在柱上，結合力較強）。

解決方法：增加咪唑的梯度洗脫或降低pH 來找出最佳的洗脫條件。

②可能原因：降低pH的方法洗脫，若pH低于3.5，會導致鎳離子脫落。

解決方法：改變洗脫辦法，如咪唑競爭性洗脫。

③可能原因：蛋白已沉淀在柱上。

解決方法：1.減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl的濃度，或在變性條件（去折疊）下洗脫（用4-8 M脲，或4-6 M鹽酸胍）；2.蛋白在柱上變性固化，用0.5M*洗柱。

④可能原因：非特異性疏水或其他相互作用。

解決方法：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl的濃度。

⑤可能原因：在填料表面形成高密度融合蛋白的聚集。

解決方法：選擇合適載量的填料，切勿一味追求高載量。

05 柱使用過程中發現堵塞嚴重，且流速越來越慢應該怎么做？

可能原因：

樣品中細胞碎片或其他雜顆粒所致。

解決方法：

樣品處理過程中，高速離心，推薦用0.45um的濾膜過濾。如果柱子堵塞嚴重，重生時使用1% Triton X-100/PBS浸泡過夜。流速慢，可在柱子下面接一根軟管。

06 鎳柱使用過程中出現棕色應該怎么做？

可能原因：

緩沖液中DTT的影響，DTT會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響，在堿性的緩沖液條件下，鎳離子會被DTT還原生成棕色的沉淀，所以要盡量避免DTT的參與。

解決方法：

若樣品中含有DTT，在上樣之前, 我們推薦采用不含還原性試劑的空白運行來除去任何較弱結合的鎳離子。

空白運行方法（使用不含還原劑的平衡液和洗脫液）：

1）5倍柱體積的雙蒸水洗柱；

2）5倍柱體積的平衡液洗柱；

3）5倍柱體積的洗脫液洗柱；

4）10倍柱體積的平衡液平衡。

當不使用時，勿將Ni Tanrose 6FF（IDA）保存于含還原性試劑的緩沖液中。